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Aureobasidin A(AbA)金担子素 A
作者:汤姆     来源:上海伟进生物科技有限公司     发布日期:2017-05-09

产品描述 

  金担子素 A(Aureobasidin A,AbA)是从丝状真菌 Aureobasidium pullulans No. R106 中分离出来的环酯肽类抗生素,具 有很强的抗真菌能力。在较低的浓度下(0.1-0.5 μg/ml)即可对酵母产生毒性。对其敏感的真菌种类包括:出牙酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、构巢曲霉 (Aspergillus nidulans)和黑曲霉(A. niger.)。作用机制在于 AbA 抑制了真菌生长所依赖的肌醇磷酰胺(inositol phosphorylceramide,IPC)合成酶的活性,干扰鞘脂合成,从而进一步杀死菌株。编码 IPC 合成酶的基因研究较多的有来自 酿酒酵母菌的 AUR1 基因,以及构巢曲霉的 AURA 基因,两者具有同源性。通过对这些编码基因进行突变即可使得菌株对 AbA 产生抗性,如 AUR1-C 基因。 AbA 非常适合用作阳性克隆子筛选用的药物选择性标记。AbA 抗性也是酵母单/双杂交研究中理想的报告子。本品为溶 于甲醇的 AbA 溶液,浓度为 1 mg/ml。具体的工作浓度取决于宿主细胞的敏感度(见表 1. AbA 对各种酵母菌的最低抑菌浓 度(MIC))。 

产品性质 

分子式(Formula) C60H92N8O11 

分子量(Molecular weight) 1,100 Da

纯度(Purity) ≥95% 

熔点(Melting point) 155-157℃ 

结构式(Structure)

 

运输和保存方法 

冰袋运输。4℃保存。

操作步骤(抗 AbA 的酵母转化系统)

1) 加入 0.5 ml 过夜培养的酵母到 50 ml YPD 培养基中(配方:1L 液体培养基含有 10g yeast extract,20g polypeptone, 20g D-glucose;固体培养基另外加入 2%琼脂;)。

2) 30℃培养约 6 小时,测定 OD660 为 1~2。使用二倍体时,测定 OD660 为 2~4。

3) 1,000×g 离心 5 分钟。

4) 用 10 ml Solution A(配方:100 mM Lithium acetate,10 mM Tris-HCl pH 7.5,1 mM EDTA)悬浮沉淀,1,000×g 离心 5 分钟。

5) 用 Solution A 重悬沉淀,直到 OD660 为 150。 

6) 在管内分取 100 µl 细胞悬浮液,30℃培养 1 小时。

7) 加入 5 µg 载体(环状或线性 DNA)和 150 µg Carrier DNA(已经过 100℃加热 10 分钟,并迅速冷却)。 注:pAUR101 需使用线性 DNA 进行转化。使用环状 DNA 会降低转化效率甚至转化不成功。pAUR112 和 pAUR123 需 使用完整的质粒 DNA 进行转化。

8) 加入 850 µl Solution B(配方:取 40 g Polyethylene Glycol 4000 溶于 100 ml Solution A 充分溶解,需要现用现配),轻轻 混匀。 

9) 30℃培养 30 分钟后,42℃培养 15 分钟。 

10) 室温放置 10 分钟。 

11) 5,000 rpm 离心 1 分钟,用 5 ml YPD 培养基悬浮沉淀。 

12) 30℃培养 6 小时~过夜。 

13) 5,000~10,000 rpm 离心,用 1-10 ml 0.9% NaCl 悬浮沉淀。

14) 在 YPD 选择培养基平板(含有一定浓度的 AbA,依菌株类型而定)上接种 100 µl 细胞悬液。30℃培养 3-4 天后转化完 成。 

15) 挑取阳性转化子,和/或测定转化效率(以每微克质粒 DNA 转化的菌落数来表示)。 

注意事项

1)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

2AbA的最佳工作浓度因宿主细胞不同而有差异,可根据最低抑菌浓度(MIC)来确定。


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