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产品关键词：

Zeocin 博莱霉素（博来霉素）；Phleomycin 腐草霉素；Sh ble基因；Streptomyces verticillus 轮枝链霉菌；Hygromycin B 潮霉素B；G418遗传霉素；CAS NO.：11006-33-0

基本描述：

Zeocin™是博来霉素/腐草霉素（bleomycin/phleomycin）抗生素家族的成员之一，从轮枝链霉菌Streptomyces verticillus中分离得到，对细菌、真菌（包括酵母菌）、植物和哺乳动物细胞具很强的毒性。来自Streptoalloteichus hindustanus的Sh ble基因赋予Zeocin抗性。

Zeocin™是腐草霉素D1的商业名称，一种碱性、水溶性、铜离子螯合的糖肽抗生素。铜离子的存在使得溶液为蓝色，此铜螯合的形式为无活性。一旦进入细胞后，二价铜离子（Cu2+）被还原为一价铜离子（Cu+），并被细胞内的巯基化合物去除。铜离子被去除后，Zeocin™被活化，嵌入DNA使其断裂，最终导致细胞死亡。

抗性基因：

Zeocin™抗性由编码一种13,665Da大小蛋白的Sh ble基因（Streptoalloteichus hindustanus bleomycin gene）赋予，该蛋白化学计量方式结合Zeocin™，抑制其DNA双链切割活性。因此，能表达此蛋白的真核和原核宿主细胞被赋予Zeocin™抗性。

基本特性：

1）CAS NO.：11006-33-0

2）化学式：C55H83N19O21S2Cu

3）分子量：1137.41 g/mol

4）外观：蓝色溶液（100mg/ml in deionized，autoclaved water）

5）运输：冰袋运输

6）保存：-30°C~-10°C，至少1年有效

7）大肠杆菌筛选：25-50μg/mL（低盐LB培养基，NaCl浓度不能超过5g/L）

8）酵母菌筛选：50-300μg/mL（YPD或基本培养基）

9）哺乳动物细胞筛选：50-1000μg/mL（合适培养基，根据细胞系而不同）

注意事项：

1）Zeocin™对光敏感，需将抗生素，或含该抗生素的平板或培养基置于黑暗处。

2）降低细菌培养基的盐浓度，调整pH到7.5使其保持活性，因高离子强度和酸或碱性都会抑制Zeocin™活性；

3）储存Zeocin™在-30°C~-10°C，使用前需冰上融化。

4）Zeocin™有毒，为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法（应用举例）：

1）大肠杆菌（E. Coli.）

宿主：不能包含Tn5转座子（比如：Top10，DH5，DH10）

培养基：使用低盐LB（10g Trypton，5g NaCl，5g Yeast extract），pH 7.5，防止Zeocin™失活

选择浓度：25-50μg/mL用于大肠杆菌筛选

2）酵母菌（Yeast）

宿主：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,毕赤酵母（Pichia pastoris）

培养基：含1M山梨醇的YPD（电转化细胞）；YPD或基本培养基（化学转化细胞）；测试培养基调pH到6.5-8.0，选择pH值允许使用最低浓度Zeocin™。

转化方法：电转法，使用锂离子步骤或使用EasyComp试剂盒。不能使用原生质体用于酵母转化，因Zeocin™会引起完整细胞死亡。

选择浓度：50-300μg/mL，取决于酵母菌类型、培养基pH和离子强度。建立杀灭曲线确定能杀死未转化宿主细胞的最低Zeocin™浓度。

3）哺乳动物细胞（Mammalian cells）

50-1000μg/mL用于筛选稳定转染细胞系（平均常用浓度为250-400μg/mL）。取决于细胞系，需要2-6周用Zeocin™筛选得到稳转集落（foci）。进行稳转株正式筛选前，需确定能够杀死所有未转染宿主细胞的最低Zeocin™浓度。

1） 确定细胞对Zeocin™的敏感性

2）筛选稳定转染细胞系

筛选小技巧：若是细胞对Zeocin™耐性更强，可用含Zeocin™培养基进行细胞分盘，并置于37°C孵育2-3h，使得细胞贴壁。然后将细胞置于4°C，2h。记得使用Hepes作为培养基的缓冲体系。重新将细胞置于37°C孵育。4°C孵育细胞的目的是短时间内终止细胞分化，使得Zeocin™能发挥作用，杀死细胞。

应用图片【Zeocin™筛选下的HEK293细胞】：

HEK293细胞用含10% FBS，1mM L-谷氨酰胺和400μg/mL双抗的培养基，分别在添加和未添加400μg/mLZeocin™的培养基选择培养。

 

图1，未经Zeocin™筛选的HEK293细胞。

 

图2，经Zeocin™筛选3天后的HEK293细胞。随着质膜破裂，往细胞外延伸长出长臂（long appendages）。（见实心箭头标注）

 

图3，经Zeocin™筛选3天后的HEK293细胞。细胞开始破裂，培养基内发现细胞颗粒。（见空心箭头标注）

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